SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。

SYBR Green I 适合于多种凝胶电泳方法：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脉冲电场凝胶电泳，和毛细管电泳等。

SYBR Green I 与双链DNA的亲和力非常高，因此可以用做电泳前染色，对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等）没有抑制作用。另外，SYBR Green I 与EB相比，诱变能力大大降低。

SYBR Green I 核酸凝胶染液(SYBR Green Nucleic Acid Gel Stains)是一种高敏感性的荧光染液，用于检测琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶中的双链DNA和寡核苷酸。当染液与核酸结合后，SYBR Green I 核酸凝胶染液的荧光信号会明显增强，因此经SYBR GreenI 核酸凝胶染液染色的凝胶显示出非常好的信噪比，没有背景荧光。为获得最佳的结果，凝胶最好在跑胶后再进行染色。SYBR GreenI 核酸凝胶染液用于低含量的PCR产物，凋亡研究及异源双链分析中少量DNA的检测较为理想。可应用于：DNA和RNA的检测；SSCP及异源双链分析。

高灵敏：至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。

信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。

操作简单：无须脱色或冲洗。

适用范围广：可适用于多种电泳分析。

使用方便：不影响其它修饰酶作用。

经济：价格比银染便宜。

1. 该方法适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳

2. 工作液的配制：用电泳缓冲液将10000×的SYBR GreenⅠ稀释100倍，即为SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一个月以上。

3. 制胶：按常规方法制胶，不含任何染料。

4. 样品染色：向分析样品中加入SYBR GreenⅠ工作液和载样缓冲液，室温放置10分钟，使SYBR GreenⅠ与样品中DNA充分结合。SYBR GreenⅠ工作液加入量为总上样量的1/10。

5. DNA Marker染色：将5μL DNA Marker和1μLSYBR GreenⅠ工作液混匀，室温放置5分钟，使SYBR GreenⅠ与DNA充分结合。

6. 上样、电泳：按常规操作。

7.检测：用ABLUe可见光核酸检测仪器检测

1. 按照常规方法进行电泳。

2. 用PH 7.0 - 8.5 的缓冲液（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000：1的比例稀释SYBR GreenⅠ浓缩液，混匀，制成染色溶液。

3. 将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。聚丙烯酰胺凝胶直接在玻璃平皿上染色，将配好的工作溶液轻轻地倒在胶板上，让工作液均匀地覆盖整个胶板，并染色30分钟。玻璃平皿必须预先经过硅烷化溶液处理（避免染料吸附在玻璃表面上）。

4. 用ABLUe观测。蓝光可透过玻璃，观测聚丙烯酰胺凝胶时，可直接将托有凝胶的玻璃平皿放入ablue内观测。

2. 在常规用酒精沉淀核酸的过程中，SYBR Green I 可以全部从双链核酸上去掉。

3. 如果想对用 SYBR Green I 染过的胶进行 Southern blots，建议在预杂化和杂化溶液中加入 0.1%- 0.3% 的SDS。

4. 在紫外照射透视下，与双链 DNA 接合的 SYBR Green I 呈现绿色荧光。如果胶中含有单链 DNA 则颜色为橘黄而不是绿色。

5. SYBR Green对玻璃和非聚丙烯材料具有一定亲合力。建议在稀释、贮存、染色等使用过程中用聚丙烯类容器。

1实验方法

囊腔组织经液氮速冻后，放入-70℃冰箱保存备用。Real-time PCR法检测EMMPRIN的mRNA含量。

1.1组织总RNA提取：

（1）从液氮中取出组织，用已处理过的剪刀剪取约100mg组织块，加入1ml Trizol试剂，转移至匀浆器中，将匀浆器置于冰水上充分研磨，转移研磨好的匀浆液至无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，室温下静置5min。

（2）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀10次充分混匀，室温下静置2-5min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间10min；

（3）小心吸取上层水相溶液至另一无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，小心吸取上层水相，勿碰及或吸走中间层，否则要重新离心再吸取（可吸取约0.4-0.5 ml）。

（4）加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温下静止15min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间15min。小心弃上清，沿管壁加入1ml 75%乙醇（DEPC水配置,预冷），室温下静置1min，4℃状态下离心，速度7500r/min，离心时间5min；小心倒掉上清，再4℃状态下离心，速度3500r/min，时间离心1min；离心后用10μl枪头小心吸去残余液体，最后用30μlDEPC-H2O溶解RNA。

（5）提取的总RNA经紫外分光光度计测定，提取物浓度OD 260/280比值在1.8-2.0之间。

1.2逆转录反应：

用上述细胞中提取的2μg总RNA在下述20μl反应体系中逆转录成cDNA,该反应体系组成如下：5×RT-Buffer 4μl, oligd(T) 2.5μmol/L, dNTPs 5mmol/L, RNA酶抑制剂（RNAsin） 20U。首先70?C预变性5min，然后加入逆转录酶MMLV 200U， 再于42?C孵育1h，72?C加热10min灭活逆转录酶。

1.3 Real-time PCR 反应：

1.3.1 方法学确认 根据引物相关信息PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并且对其纯化，假设纯化所得DNA浓度为a×10x，对其做10倍梯度稀释7次，稀释浓度依次为a×10x-1、a×10x-2、a×10x-3、a×10x-4、a×10x-5、a×10x-6、a×10x-7选择合适稀释品作为标准品模板。

1.3.2 取上述逆转录反应产物于20μl反应体系中进行PCR反应。。

PrimerSequence (5′to 3′)Length（bp）

GAPDH Forward primer5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3'276

GAPDH Reverse primer5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3'

EMMPRINForward primer5’- TGGCCTTCACGTTCCTGAGT -3’215

EMMPRINReverse primer5’ - GTCATCTGCATCCACCGTGT-3’

反应体系组成如下：10×Buffer（2μl）、dNTP 10 mmol /L(0.4μl)、MgCl2 25mmol/L (1.6μl)、5U TaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板2μl、上、下游特异引物各0.25μl、去离子水16.2μl。

按下述热循环参数运行：GAPDH内参照基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火56×15s，延伸72×15S（采光） 共30个循环。EMMPRIN基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火58×15s，延伸72×12s （采光）共35个循环。以SLAN软件分析并计算目的基因EMMPRIN与GAPDH的Ct值。

2 实验结果

2.1内参照基因、目的基因琼脂糖凝胶电泳结果：随机选择3份标本PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在理论片段大小位置有单一条带且无杂带和引物二聚体。

2.2 试剂扩增效率验证：经过对标准品定量，内参照基因GAPDH扩增检测Ct值与浓度对数值的相关系数为0.99996，目的基因EMMPRIN扩增检测Ct值与浓度对数值的相关系数为0.99969。内参照基因和目的基因皆有良好的扩增效率（相关系数>0.98）。可用ΔCt法行数据统计。